一、準備工作

1. 試(shi)劑準備：培養細胞所需的培養基(ji)、胰酶、胎牛血清（簡稱(cheng)FBS）、雙抗（簡稱(cheng)P/S）、PBS緩(huan)沖液等從4°C的冰箱(xiang)中取出，于室溫條件下放置至(zhi)恢復室溫。

2. 耗材(cai)準(zhun)備(bei)：50ml離心管、15ml離心管及移(yi)液(ye)槍。

3. 實驗條件(jian)準備：打開超凈臺紫外(wai)線照(zhao)射30min之(zhi)后通風(feng)3-5min即可開始實驗。

二、實驗步驟

1.潔(jie)凈(jing)要求：進入(ru)細胞間后(hou)，穿(chuan)好(hao)實(shi)驗(yan)服，戴好(hao)口(kou)罩手套等實(shi)驗(yan)裝備，將上述試劑(ji)耗材用酒精噴洗后(hou)放(fang)入(ru)超凈(jing)臺，手部同(tong)樣(yang)酒精噴洗后(hou)放(fang)入(ru)超凈(jing)臺，手部同(tong)樣(yang)酒精噴洗即可開始。

2.試劑分裝(zhuang)及配制(zhi)：

（1）配制（血(xue)清）細(xi)胞培養(yang)基：（血(xue)清）細(xi)胞培養(yang)基（血(xue)清占總(zong)體(ti)積(ji)10%，雙抗占總(zong)體(ti)積(ji)1%的基礎(chu)培養(yang)基混合液(ye)）一(yi)(yi)般用(yong)50ml離心(xin)管配制，減(jian)少污染的概率。即在(zai)50 ml離心(xin)管中加入(ru)(ru)5ml FBS和500μL P/S后倒入(ru)(ru)基礎(chu)培養(yang)基定容到50ml，即得50ml（血(xue)清）細(xi)胞培養(yang)基。用(yong)馬克筆在(zai)離心(xin)管壁上(shang)寫(xie)好配制時間(jian)及(ji)溶液(ye)成分(fen)。放于一(yi)(yi)旁試劑架(jia)上(shang)備(bei)用(yong)。

（2）分裝PBS：將PBS從(cong)瓶中倒(dao)入50ml離心管中，倒(dao)PBS時注(zhu)意瓶口(kou)和(he)管口(kou)不要接觸，防止整(zheng)瓶污染。標記好后也置于試劑架(jia)上備用(yong)。

3.細胞消化及傳(chuan)代：

（1）細(xi)(xi)胞狀(zhuang)態(tai)的(de)(de)觀(guan)察及傳代準備：手部酒精噴洗(xi)后，將(jiang)細(xi)(xi)胞培(pei)養(yang)(yang)(yang)皿(min)或培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶從恒(heng)溫培(pei)養(yang)(yang)(yang)箱中(zhong)取出，于倒置顯微鏡下觀(guan)察細(xi)(xi)胞密度，已經生長到80%-90%的(de)(de)細(xi)(xi)胞密度即可傳代。手部再次酒精噴洗(xi)，順便將(jiang)培(pei)養(yang)(yang)(yang)皿(min)也(ye)噴一下，放(fang)入(ru)超(chao)凈臺(tai)。

（2）清洗(xi)：先用(yong)(yong)移(yi)液(ye)槍移(yi)除原有細胞(bao)培(pei)養液(ye)，更換(huan)槍頭后(hou)加入2ml PBS清洗(xi)1~2次（沿培(pei)養皿壁處加入，防(fang)止(zhi)沖散貼壁細胞(bao)，加入后(hou)輕(qing)輕(qing)搖蕩，洗(xi)去殘余的(de)培(pei)養液(ye)和懸浮(fu)的(de)細胞(bao)），用(yong)(yong)移(yi)液(ye)槍移(yi)除PBS；注意棄掉(diao)PBS時，槍頭應在廢(fei)液(ye)缸上方(fang)，不(bu)要將槍頭伸入廢(fei)液(ye)缸中，防(fang)止(zhi)回濺造成(cheng)污(wu)染。

（3）消化：沿培養皿(min)側壁加入1-2ml胰酶（能夠覆蓋(gai)細(xi)(xi)胞(bao)表(biao)面即可）消化約2-5min（水解細(xi)(xi)胞(bao)間蛋白質，使(shi)貼壁細(xi)(xi)胞(bao)脫離附著(zhu)的底物，解離、分散細(xi)(xi)胞(bao)），在(zai)倒置顯微鏡下觀察到細(xi)(xi)胞(bao)形態由不規則逐(zhu)漸皺(zhou)縮為(wei)圓形即為(wei)全部(bu)消化。

（4）終止消化：加(jia)入3ml（血清）細胞(bao)培養(yang)基或將加(jia)入的胰酶(mei)棄去均(jun)可(ke)終止胰酶(mei)消化。用移液槍反復吹(chui)打(da)培養(yang)皿皿底壁(bi)(bi)或培養(yang)瓶底壁(bi)(bi)使細胞(bao)脫(tuo)離皿底壁(bi)(bi)（注(zhu)意邊緣地帶和四角處(chu)，吹(chui)打(da)力(li)度適中，防止產(chan)生傷害細胞(bao)的氣泡(pao)）。

（5）離(li)心(xin)(xin)：取吹打后的培養(yang)液轉移(yi)至(zhi)15 ml離(li)心(xin)(xin)管中，離(li)心(xin)(xin)機1000rpm，5min得到單細胞沉淀(dian)。

（6）為節省時間，可(ke)在離(li)心過程中準(zhun)備傳代(dai)所需的培養(yang)皿(min)（1:n傳代(dai)就準(zhun)備n個培養(yang)皿(min)），各加入9 ml（血清(qing)）細(xi)胞(bao)培養(yang)基，在皿(min)蓋上標好培養(yang)的細(xi)胞(bao)種類、細(xi)胞(bao)代(dai)數、傳代(dai)時間和操作人員。

（7）離心好的細(xi)胞(bao)棄上清得到單細(xi)胞(bao)沉淀，將細(xi)胞(bao)沉淀用2-3ml完(wan)整培(pei)養(yang)液重新(xin)懸浮，分n份分別加(jia)入剛剛的培(pei)養(yang)皿中，并(bing)于光學(xue)顯微(wei)鏡下觀察細(xi)胞(bao)密(mi)度。酒精噴(pen)洗后放入恒溫培(pei)養(yang)箱培(pei)養(yang)即可。（10cm皿一皿培(pei)養(yang)基10ml；T25細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)瓶一瓶培(pei)養(yang)基5ml）。

4.結束操作：

（1）將所有(you)未用完試劑的離心管用封口(kou)膜(mo)包好，同(tong)廢(fei)液缸(gang)一起拿出超凈臺。

（2）整理移液槍及耗材位置，用酒精(jing)噴(pen)濕吸水(shui)紙擦拭超(chao)凈(jing)臺，關閉超(chao)凈(jing)臺燈光。

（3）廢液(ye)(ye)倒(dao)入廢液(ye)(ye)回(hui)收瓶，廢棄耗材(cai)裝入黃色專用垃圾袋，等待(dai)統一回(hui)收處理。試劑放回(hui)4℃冰箱中冷(leng)藏。

（4）記(ji)錄今日實驗操作內容及(ji)結果，方便日后回顧。

三、注意事項

1、細胞消化(hua)中的注意事項

（1）消化細胞可能會由(you)于商品(pin)化胰酶的品(pin)牌、實(shi)驗室溫度或細胞種類等造(zao)成消化時(shi)間(jian)上的差異，建議第一次消化細胞時(shi)在加(jia)入胰酶后就轉移至倒置顯微鏡下觀察細胞狀態并記錄時(shi)間(jian)。

（2）消化細胞熟練(lian)之后可(ke)以觀察到消化完成后的培養皿或培養瓶底壁呈現(xian)霧面。

（3）若(ruo)5min后細胞(bao)狀態沒有明顯變化，可以將培養皿重(zhong)新(xin)放回培養箱(xiang)在37℃下孵(fu)育(yu)消化，或(huo)者更(geng)換(huan)別(bie)的品(pin)牌的胰酶嘗試。

（4）若消(xiao)化(hua)過度則細(xi)胞會(hui)隨(sui)著分散在胰酶中(zhong)，此時棄去胰酶終(zhong)止消(xiao)化(hua)會(hui)造成細(xi)胞的(de)損失，應加入含血清(qing)的(de)培(pei)養基終(zhong)止消(xiao)化(hua)后離心去除。

（5）若(ruo)細胞未全部消(xiao)化就終止消(xiao)化，細胞會貼(tie)在(zai)皿(min)底(di)很難吹打(da)下來，可以再加入胰(yi)酶重新消(xiao)化。

2、細胞(bao)傳代時的(de)注意事項

（1）首先(xian)可以在ATCC上查(cha)找細(xi)(xi)胞(bao)的傳(chuan)代比例(li)，然后根據細(xi)(xi)胞(bao)培養的狀態判斷傳(chuan)代的合(he)適比例(li)。若細(xi)(xi)胞(bao)傳(chuan)代過稀(xi)則可能(neng)會導致細(xi)(xi)胞(bao)不(bu)能(neng)擴增(zeng)，若過密則影響細(xi)(xi)胞(bao)生長狀態。

（2）細(xi)(xi)胞傳代(dai)(dai)天數的控(kong)制也很重要。若長時(shi)間不傳代(dai)(dai)，細(xi)(xi)胞培(pei)養基顏色(se)變(bian)黃，則證明培(pei)養基中的pH發(fa)生(sheng)變(bian)化，會影響細(xi)(xi)胞狀態。

以(yi)上就是本期的內容，更(geng)多資訊，。

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