流式細胞技術（Flow Cytometry,簡稱FCM）是(shi)一種(zhong)高效(xiao)的方法，用于分析和收集(ji)細胞懸(xuan)液中的單個(ge)細胞。FCM的優勢在于其速度快、結果客觀，并且具有(you)重要(yao)的統計意義。它能夠處理復(fu)雜的樣本，同(tong)時收集多個參(can)數，其可靠性和重復(fu)性都非常出色。

今天(tian)我將(jiang)總結并分享一系列關(guan)于流(liu)式(shi)細胞技術(shu)的(de)常見問(wen)題及其分析。對于流(liu)式(shi)細胞(bao)術的(de)原理和(he)步驟(zou)不甚清晰的(de)同學，建(jian)議先閱讀本公眾號以往(wang)的(de)文章，了解背(bei)景知識。

1.熒光(guang)抗體染色無信(xin)號(hao)或信(xin)號(hao)弱

（1）加入(ru)的抗體量不足：這是普通的(de)一種情況，只需要(yao)摸(mo)索實驗(yan)條件，適當(dang)增加抗體(ti)的(de)量或濃度。

（2）細胞數量(liang)過多：熒光弱可能是(shi)因(yin)為細(xi)胞相對于(yu)染(ran)料太多了(le)，應該正確地(di)調整細(xi)胞的密度，一般低(di)于(yu)1*10^7個/ml。

（3）抗體儲(chu)存方式不對(dui)：抗體沒有保存在4℃并且避光(guang)，比如冷凍（-20℃甚至更低）保存可(ke)能(neng)會導(dao)致熒光抗(kang)體的沉降(jiang)，顯著影響抗(kang)體染色效(xiao)果。

（4）用于細胞內(nei)染色(se)的熒光染料分子量(liang)太大：染(ran)料體積太(tai)大，因此其(qi)進(jin)入細胞的(de)可能(neng)性降低。

（5）一抗(kang)和二抗(kang)不相容(rong)：使用(yong)的二(er)抗應(ying)與一抗的物(wu)種來源相同（例如，一抗為兔(tu)源，則應(ying)該使用(yong)抗兔(tu)源二(er)抗）。

（6）儀(yi)器問(wen)題：（流式(shi)細胞儀的(de)(de)光(guang)(guang)學系統由三(san)個部分組(zu)成：激光(guang)(guang)器(qi)、濾光(guang)(guang)片和檢(jian)測器(qi)。激光(guang)(guang)器(qi)的(de)(de)數(shu)量、檢(jian)測器(qi)的(de)(de)數(shu)量以及(ji)濾光(guang)(guang)器(qi)的(de)(de)類(lei)型(xing)共(gong)同決定儀器(qi)的(de)(de)檢(jian)測范(fan)圍）。這三(san)部分之一出現問(wen)題的(de)(de)時候，就無法(fa)檢(jian)測到熒(ying)光(guang)(guang)信號(hao)。

如濾光片選擇有誤(wu)：不同熒光(guang)有不同的(de)發射譜，為了(le)檢測到信號(hao)，需要(yao)搭配(pei)能夠捕捉到該(gai)波長(chang)信號(hao)的(de)濾(lv)光(guang)片（濾(lv)光(guang)片可以將(jiang)熒光(guang)激發后產生的(de)相(xiang)應(ying)波長(chang)的(de)光(guang)子引導(dao)至特(te)定的(de)傳(chuan)感器(qi)上(shang)）；激(ji)光器沒有對齊：必(bi)要時(shi)通(tong)過運行液流(liu)檢(jian)查微(wei)珠來調整路線。

（7）靶蛋白不存在/表(biao)達水(shui)平低：巧婦難為無(wu)米之(zhi)炊，要給靶蛋白染色，至少要確保組織/細胞類型表達(da)的靶(ba)蛋白至少處(chu)于足夠檢測(ce)的量。

（8）靶蛋白存(cun)在于細胞(bao)(bao)表面還是(shi)細胞(bao)(bao)內：有(you)些(xie)抗原表(biao)(biao)(biao)達(da)在(zai)細胞表(biao)(biao)(biao)面，有(you)些(xie)表(biao)(biao)(biao)達(da)在(zai)胞漿(jiang)、細胞器內、胞核(he)，甚至有(you)些(xie)在(zai)所有(you)部位都表(biao)(biao)(biao)達(da)。比如對細胞系(xi)進行(xing)染(ran)色時，胰蛋白(bai)(bai)酶通常可以引起(qi)細胞表(biao)(biao)(biao)面蛋白(bai)(bai)的內化，因(yin)此需要確定好(hao)抗原的表(biao)(biao)(biao)達(da)位置，選擇合(he)適的染(ran)色方法。

（9）靶蛋白的表達(da)需要經過誘(you)導：有些抗(kang)原在(zai)活化后發生下調，而有些蛋白則需(xu)要被誘(you)導才能表達。因此(ci)要選擇合適的方法激活細(xi)胞(bao)，使(shi)其充分表達靶蛋白，同時要加蛋白轉運(yun)抑制劑使(shi)其留在(zai)胞(bao)內，然(ran)后固定破(po)膜，染相(xiang)應抗(kang)體(ti)。

（10）靶蛋白是分泌蛋白：分泌蛋白(bai)的(de)檢(jian)測十(shi)分困難(nan)，因為蛋白(bai)會在檢(jian)測前從細胞(bao)中釋放出來(lai)且可能快速降解。高爾(er)基(ji)體阻(zu)斷劑(ji)（如布雷(lei)非德(de)菌素A）可用(yong)于(yu)抑制表達蛋(dan)白(bai)的(de)分泌，使其(qi)仍保留(liu)在高爾基體中。然后再用(yong)細胞(bao)內染色法(fa)檢測靶標(biao)蛋(dan)白(bai)。

（11）補(bu)償過高：使用陽性(xing)對照再次正(zheng)確設置流式(shi)細(xi)胞(bao)儀(yi)

2.熒光強度過高

（1）抗體濃度過高(gao)：這將會導(dao)致(zhi)非常明顯的非特異性(xing)結合或者是(shi)特異性(xing)結合的高強度熒(ying)光。

（2）過多抗體被捕獲于細胞內：在(zai)(zai)胞內染色的時候，較大的熒(ying)光分子被困在(zai)(zai)細(xi)胞內部。

（3）封閉不足：封(feng)閉(bi)這個操作可(ke)以有效地減少染料和蛋白的非特異性結(jie)合。

3.在應該(gai)只有一個(ge)細胞群的情況下觀察到多(duo)個(ge)細胞群

（1）樣品本身含(han)有(you)多個表(biao)達(da)靶蛋白的細胞群：有(you)可(ke)能是(shi)因為表達該靶蛋白的(de)細胞群不(bu)止一個，但操(cao)作(zuo)過程中沒有(you)做(zuo)好分離。

（2）出現細胞雙(shuang)峰：出(chu)現了第一群(qun)兩倍熒光(guang)強度的第二群(qun)細(xi)胞。可能是(shi)細(xi)胞分離不充分甚至是(shi)細(xi)胞團(tuan)塊沒有過(guo)濾掉，導致檢測時多個(ge)細(xi)胞聚集在(zai)一起(qi)。

4.儀器檢(jian)測(ce)到的粒子太少

(這(zhe)里的(de)粒子指(zhi)的(de)是上樣時儀器(qi)檢(jian)測到的(de)微粒，有可能是細(xi)(xi)(xi)胞，也有可能是破碎(sui)細(xi)(xi)(xi)胞產(chan)生的(de)細(xi)(xi)(xi)胞器(qi)，或者沒有充分(fen)分(fen)離而形成的(de)細(xi)(xi)(xi)胞團塊）

（1）細胞密度低：即每毫(hao)升樣品的(de)細胞數目太(tai)少，自然檢測的(de)效率(lv)就不高。

（2）檢測(ce)的(de)參數當中電壓設置得太低。

（3）細胞(bao)聚集，堵塞管道：多個細胞(bao)聚集成(cheng)團快，卻被檢測(ce)成(cheng)一個粒子，且該(gai)粒子大小(xiao)是異常(chang)的(de)，在后續圈門也(ye)有(you)可(ke)能被廢棄。染(ran)色前要輕輕吹打幾次(ci)，確(que)保形成(cheng)單細胞(bao)懸液，上樣之(zhi)前最(zui)好再次(ci)混勻。另外，染(ran)細胞(bao)死活對于這一問題也(ye)有(you)幫助，因為死細胞(bao)會(hui)釋放它(ta)的(de)DNA，而DNA非常粘稠，最后會(hui)導致(zhi)細胞成團。

5.背景高或陽性細胞(bao)百分(fen)比高

（1）抗體過量。

（2）補償過低(di)：流式細胞分析(xi)中(zhong)經常(chang)要用到2種(zhong)以(yi)上(shang)的(de)熒光(guang)標(biao)記(ji)抗體進行染色，而目前所(suo)使(shi)用的(de)多種(zhong)熒光(guang)染料發射譜間(jian)有一定重(zhong)疊，也(ye)就是說，熒光(guang)A的激發光會有一(yi)部分被熒光B的(de)通道(dao)檢測到，這(zhe)就(jiu)(jiu)是(shi)(shi)熒(ying)光(guang)溢(yi)(yi)(yi)漏(lou)。例(li)如，當我們在進行單(dan)色流(liu)式(shi)實驗(yan)的(de)時候，可以在其他(ta)通道(dao)砍(kan)到熒(ying)光(guang)信號，這(zhe)些熒(ying)光(guang)信號就(jiu)(jiu)是(shi)(shi)溢(yi)(yi)(yi)漏(lou)出來的(de)熒(ying)光(guang)，而糾正熒(ying)光(guang)溢(yi)(yi)(yi)漏(lou)的(de)過(guo)程就(jiu)(jiu)是(shi)(shi)“補償(chang)"。補償(chang)太低，就(jiu)(jiu)無法(fa)正確地糾正這(zhe)些溢(yi)(yi)(yi)漏(lou)的(de)熒(ying)光(guang)信號，使(shi)背景變高。

6.側向散射（反映細胞(bao)的(de)顆粒(li)度）背景(jing)高

（1）細胞裂解過度(du)：制備樣品時離(li)心或振蕩過度，使細胞破(po)碎產生細胞碎片。

（2）細菌污(wu)染：從其它微(wei)小顆粒(li)和背(bei)景(jing)信號中區分細菌(jun)群落(luo)(luo)的方法是用(yong)熒光染料標記細菌(jun)，然后使用(yong)該熒光來識別(bie)目標群落(luo)(luo)。

（3）死細(xi)胞的處理(li)：流式細(xi)(xi)胞(bao)術非常容易被死細(xi)(xi)胞(bao)干擾，因(yin)為死細(xi)(xi)胞(bao)比(bi)活細(xi)(xi)胞(bao)更容易攝取抗體和探針，導(dao)致明顯的(de)非特(te)異性染色。且死細(xi)(xi)胞(bao)的(de)自發(fa)熒(ying)光往往特(te)別強，這樣背景熒(ying)光變強，就無(wu)法觀察到(dao)一些(xie)靶蛋白的(de)弱陽性表達了(le)。

以上(shang)就是本期的內容，更多資訊，。

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