在生(sheng)物(wu)醫學實(shi)(shi)驗中，細(xi)(xi)胞(bao)培養(yang)(yang)是基(ji)礎中的(de)(de)(de)基(ji)礎，大部分實(shi)(shi)驗只需要(yao)(yao)用到相關細(xi)(xi)胞(bao)系的(de)(de)(de)培養(yang)(yang)，但對實(shi)(shi)驗動物(wu)原代(dai)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)培養(yang)(yang)也是非常重(zhong)要(yao)(yao)的(de)(de)(de)。脾臟T細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)分離和(he)培養(yang)(yang)就是免疫學領(ling)域的(de)(de)(de)一種非常基(ji)礎和(he)重(zhong)要(yao)(yao)實(shi)(shi)驗方法。本文(wen)將詳細(xi)(xi)探討小鼠(shu)脾臟T細(xi)(xi)胞(bao)分離培養的關鍵步驟，幫助大家更有效地進行實驗操作(zuo)。

一、實驗目的(de)

提取小鼠脾(pi)臟的(de)naive CD4+ T細胞，研究(jiu)某(mou)種因素對naive CD4+ T細胞或某(mou)一(yi)(yi)亞(ya)型的(de)CD4+ T細胞增殖分化和功能狀態的(de)影響(xiang)，或者在誘導分化為CD4+ T細胞的(de)某(mou)一(yi)(yi)亞(ya)型后做下游實(shi)驗。

二、實驗內容

小鼠脾臟naive CD4+ T細胞的(de)分(fen)離和(he)原代培養

三、實驗(yan)條件

動物房超凈臺、細胞房超凈臺

四、實(shi)驗設計原理(li)和方法(fa)

原代細胞的培(pei)養(yang)實(shi)驗中，無菌分選是(shi)關鍵。磁珠(zhu)分(fen)(fen)選（MACS）和流式分(fen)(fen)選（FACS）是最經常使用的兩種分(fen)離特定(ding)細胞(bao)的方法。

流式(shi)分選可(ke)以有以下特(te)點：

1.實現單(dan)個細胞的分選

2.同時分選多(duo)種(zhong)細胞

3.可以(yi)基于細(xi)胞表(biao)面標(biao)志物表(biao)達水平進(jin)行分選

4.可以基(ji)于細胞(bao)內標(biao)志物進行分選

5.可(ke)以分選由多(duo)個標志物復(fu)雜組合的細胞類型(xing)

磁(ci)珠(zhu)分(fen)選(xuan)是(shi)(shi)基(ji)于細(xi)胞表面抗原能(neng)與連接有磁(ci)珠(zhu)的(de)(de)(de)特異性(xing)(xing)單抗結合(he)(he)，在(zai)外(wai)界磁(ci)場中與抗體結合(he)(he)的(de)(de)(de)細(xi)胞被吸(xi)附而滯留在(zai)分(fen)選(xuan)柱(zhu)內(nei)，而缺乏(fa)該表面抗原的(de)(de)(de)細(xi)胞則不能(neng)在(zai)分(fen)選(xuan)柱(zhu)內(nei)停留。分(fen)為陽性(xing)(xing)分(fen)選(xuan)（磁(ci)珠(zhu)結合(he)(he)的(de)(de)(de)細(xi)胞是(shi)(shi)目的(de)(de)(de)細(xi)胞）和陰性(xing)(xing)分(fen)選(xuan)（磁(ci)珠(zhu)結合(he)(he)的(de)(de)(de)細(xi)胞是(shi)(shi)非目的(de)(de)(de)細(xi)胞）兩種分(fen)選(xuan)策略。

與流(liu)式分(fen)選(xuan)(xuan)相比，磁珠(zhu)分(fen)選(xuan)(xuan)更(geng)簡便更(geng)快(kuai)捷，是分(fen)離常見細胞類型的第一(yi)選(xuan)(xuan)擇。在樣本(ben)量較大或分(fen)選(xuan)(xuan)稀有細胞類型時(shi)，先(xian)磁珠(zhu)分(fen)選(xuan)(xuan)后流(liu)式分(fen)選(xuan)(xuan)的方案能夠(gou)顯著提高(gao)分(fen)選(xuan)(xuan)的效率(lv)。

五、實(shi)驗(yan)材料

（一）10cm培養皿(min)、PBS、75%酒精、24孔板(ban)、手(shou)術器械（兩套(tao)）

（二(er)）STEMCELL磁(ci)珠(zhu)分選(xuan)儀器、磁(ci)珠(zhu)分選(xuan)磁(ci)力架、分選(xuan)柱、70um細胞濾網、裂紅液(ye)

六、實驗步驟

（一）取脾（動物房(fang)超凈臺）

1.將小鼠(shu)脫頸處死，用(yong)75%酒(jiu)精浸泡一分鐘(zhong)后放入10cm培養皿中(zhong)準備解剖，使用(yong)不同的小鼠(shu)品系可能(neng)會影響產(chan)(chan)量和性能(neng)。例如，來自C57BL/6小鼠(shu)的細胞(bao)更(geng)好地產(chan)(chan)生(sheng)Th1細胞(bao)，而(er)來自Balb.c小鼠(shu)的細胞(bao)更(geng)好地產(chan)(chan)生(sheng)Th2細胞。；

2.第(di)(di)一套器(qi)械(xie)用(yong)(yong)于(yu)剪開分離(li)皮膚肌肉，暴露出足夠的(de)視(shi)野時(shi)，換用(yong)(yong)第(di)(di)二套器(qi)械(xie)用(yong)(yong)于(yu)取脾。之后(hou)處理每一只(zhi)小鼠時(shi)，第(di)(di)一套和第(di)(di)二套器(qi)械(xie)都不要混用(yong)(yong)；

3.取出的(de)脾放入裝(zhuang)著PBS的(de)24孔板(ban)中(zhong)。

（二）制備單細胞(bao)懸液（細胞(bao)房超凈臺(tai)）

1.將脾臟(zang)放在70um細胞濾網上，研磨并加入5ml PBS（一個脾臟(zang)用5ml）過濾，過濾至15ml/50ml離(li)心管(guan)中，這(zhe)一步建議過濾兩次，否(fou)則會在后續離(li)心時形成(cheng)富含纖維(wei)的沉(chen)(chen)淀(dian)，棄置此沉(chen)(chen)淀(dian)又會浪費很多細胞；

2.600g離心5min，棄(qi)上清。每個(ge)脾臟5ml/10ml裂紅(hong)液(ye)重懸，室溫裂紅(hong)5min，加入2ml/4ml PBS（與裂紅(hong)液(ye)體積對應）終止；

3.600g離心5min，棄上清。每管脾臟取1-2ml PBS重懸(xuan)，從中取出100ul依次(ci)稀釋(shi)成(cheng)10倍和100倍；

4.從10倍和(he)100倍稀(xi)釋液中取出10ul放(fang)入細胞(bao)計數(shu)板，進行計數(shu)。

（三(san)）磁珠陽性(xing)分選（細胞房超凈(jing)臺(tai)）

磁珠分(fen)選大致分(fen)為(wei)三個步驟：潤(run)洗（用(yong)分(fen)選buffer潤(run)洗分(fen)選柱(zhu)）、過濾（多次重復(fu)過濾細胞(bao)(bao)懸液(ye)）、洗滌(di)（用(yong)分(fen)選buffer洗滌(di)柱(zhu)子，使(shi)細胞(bao)(bao)洗脫）。

（四(si)）T細胞分化培養基制備(bei)（細胞房(fang)超凈臺）

1.磁珠分選(xuan)前一天（也就是Day0）準備培養板，加入250ul anti-mouse CD3（2 µg/mL或3 µg/mL，用PBS稀釋(shi)），37℃孵育2小時(shi)或4℃過夜(ye)包(bao)被(bei)。

2.配置T細胞(bao)基(ji)礎培養基(ji)（50ml）：48.5ml的1640（血清）細胞(bao)培養基(ji)、0.5ml HEPES、0.5ml GlutaMAX、0.5ml丙酮酸鈉、50ul 2-ME；

3.重懸分裝各(ge)類細胞因子，最終濃度為10ug/ml，于(yu)-20℃保存；

4.配置各種(zhong)分化培養基（用24孔(kong)板進行分化培養，每(mei)個(ge)孔(kong)加入(ru)1ml培養基）

（1）Th1：10ml基(ji)礎T細(xi)胞培養基(ji)，加入10ul IL-2，10ul IL-12，10.3ul IL-4抗體；

（2）Th2：10ml基(ji)(ji)礎(chu)T細胞培養基(ji)(ji)，加(jia)入10ul IL-2，10ul IL-4，11.5ul IFN抗體；

（3）Treg：10ml基礎(chu)T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul TGF-β；

（4）Th17：10ml基(ji)礎T細胞培養基(ji)，加(jia)入10ul IL-2，2ul TGF-β，20ul IL-6，10ul IL-1β，10.3ul IL-4抗(kang)體(ti)，11.5ul IFN抗(kang)體(ti)；

（以上培養(yang)基在(zai)4℃僅能保存一周(zhou)）

5.每(mei)1ml細胞懸液（10^6個細胞）加入25ul CD3/CD28磁珠，振蕩混勻(yun)。不論任何分化(hua)體系都需要有CD3/CD28/IL-2的參與，這3者是(shi)T細胞增殖的基本功能抗體和細胞因子；

6.將分選出的(de)naive CD4+ T細胞(bao)(bao)離心(xin)，按照你想要研究的(de)亞型分成不同部(bu)分，用各自的(de)分化培(pei)養基重懸，以10^6個細胞(bao)(bao)/1ml加到24孔板中(zhong)培(pei)養

7.Day2.3 僅(jin)觀察；Day 4 直接在原孔(kong)中補充分化培養基(ji)；Day5 僅(jin)觀察；Day6 收(shou)取細胞(bao)，通過流式檢測分泌(mi)的(de)細胞(bao)因子(zi)的(de)水(shui)平(ping)，進(jin)行后續實(shi)驗。

以上(shang)就是本期的內容(rong)，更(geng)多資訊，。

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