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神奇的生物素biotin
發布時間： 2023-03-26 點擊次數： 176次1. 什么是生物素？
物(wu)素(su)(su)分(fen)(fen)子量為244.31，分(fen)(fen)子中有兩個環(huan)(huan)(huan)狀結構，其中I環(huan)(huan)(huan)為咪唑酮環(huan)(huan)(huan)，是與親合(he)(he)素(su)(su)結合(he)(he)的(de)(de)主(zhu)要(yao)部(bu)位；II環(huan)(huan)(huan)為噻唑環(huan)(huan)(huan)，上有一戊酸側鏈(lian)，其末端羧(suo)基(ji)(ji)是結合(he)(he)抗體和其他生(sheng)物(wu)大(da)分(fen)(fen)子的(de)(de)結構。利(li)用(yong)生(sheng)物(wu)素(su)(su)的(de)(de)羧(suo)基(ji)(ji)加以化(hua)學修(xiu)飾可制(zhi)成各種活(huo)性(xing)基(ji)(ji)團(tuan)的(de)(de)衍生(sheng)物(wu)，稱為活(huo)化(hua)生(sheng)物(wu)素(su)(su)，同時可根(gen)據特殊的(de)(de)用(yong)途對這些試劑(ji)的(de)(de)化(hua)學性(xing)質（溶解(jie)性(xing)、臂長、可剪切與否(fou)）進(jin)行優化(hua)，以適合(he)(he)與各種生(sheng)物(wu)大(da)分(fen)(fen)子結合(he)(he)的(de)(de)需要(yao)。
生物(wu)素
2. 什么是生(sheng)物素化(hua)？
生物(wu)(wu)素化是指將化學物(wu)(wu)質(zhi)或分(fen)子與生物(wu)(wu)素（biotin）結合在一起的(de)過程。生物(wu)(wu)素是一種水(shui)溶性的(de)維生素，也(ye)被稱為維生素B7或(huo)(huo)維生(sheng)素H，它在許多生(sheng)物(wu)體的(de)生(sheng)物(wu)化(hua)(hua)學過(guo)程中(zhong)(zhong)發揮著重要作用(yong)。生(sheng)物(wu)素可以通(tong)過(guo)化(hua)(hua)學合成或(huo)(huo)從天然(ran)來源（如食物(wu)中(zhong)(zhong)）獲(huo)得(de)。生(sheng)物(wu)素化(hua)(hua)通(tong)常在生(sheng)物(wu)實驗室中(zhong)(zhong)用(yong)于標記和檢(jian)測(ce)特定的(de)分(fen)子或(huo)(huo)蛋(dan)白質，其(qi)中(zhong)(zhong)生(sheng)物(wu)素與待檢(jian)測(ce)的(de)分(fen)子或(huo)(huo)蛋(dan)白質結合，然(ran)后可以通(tong)過(guo)生(sheng)物(wu)素與其(qi)他分(fen)子之間的(de)特異性相互作用(yong)來檢(jian)測(ce)或(huo)(huo)純化(hua)(hua)目標分(fen)子。
3. 什么是生物(wu)素-鏈霉親和素（SA-Biotin）系統？
Streptavidin是(shi)(shi)一(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)具(ju)有(you)四(si)個相同結合(he)(he)位點的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)，它(ta)(ta)能(neng)夠與(yu)生(sheng)物素(su)(su)結合(he)(he)形(xing)成非(fei)(fei)常(chang)(chang)緊密的(de)(de)(de)(de)(de)復合(he)(he)物，也是(shi)(shi)已知的(de)(de)(de)(de)(de)非(fei)(fei)共價相互作(zuo)用(yong)(yong)(yong)之一(yi)（解離常(chang)(chang)數 (Kd) 約為 10x-15 mol/L）。生(sheng)物素(su)(su)和(he)(he)Streptavidin之間的(de)(de)(de)(de)(de)鍵形(xing)成非(fei)(fei)常(chang)(chang)迅速，一(yi)旦形(xing)成，它(ta)(ta)不受(shou)pH值(zhi)、溫度、有(you)機(ji)溶(rong)劑和(he)(he)其他(ta)變質(zhi)劑的(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響。生(sheng)物素(su)(su)與(yu)Streptavidin之間的(de)(de)(de)(de)(de)結合(he)(he)非(fei)(fei)常(chang)(chang)特異，因為它(ta)(ta)們之間存在(zai)著高(gao)度親(qin)和(he)(he)力(li)。這種(zhong)(zhong)(zhong)親(qin)和(he)(he)力(li)使得生(sheng)物素(su)(su)-Streptavidin復合(he)(he)物成為一(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)非(fei)(fei)常(chang)(chang)有(you)用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)工具(ju)，用(yong)(yong)(yong)于(yu)檢(jian)測(ce)、分(fen)離和(he)(he)純化(hua)許多(duo)生(sheng)物分(fen)子，例如蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)、DNA或RNA。生(sheng)物素(su)(su)與(yu)Streptavidin互作(zuo)通常(chang)(chang)被用(yong)(yong)(yong)于(yu)許多(duo)生(sheng)物學(xue)實(shi)驗中的(de)(de)(de)(de)(de)標記(ji)和(he)(he)純化(hua)技術，這種(zhong)(zhong)(zhong)相互作(zuo)用(yong)(yong)(yong)也被廣(guang)泛用(yong)(yong)(yong)于(yu)結合(he)(he)生(sheng)物(wu)分(fen)子（如蛋白(bai)質(zhi)、脂(zhi)質(zhi)和核(he)酸(suan)）、合成分(fen)子（如熒光標記）、生(sheng)物(wu)芯片(pian)技術、免疫組化、Western blot分(fen)析和其(qi)他分(fen)子生(sheng)物(wu)學實驗中。
生物(wu)素(su)-鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)系(xi)統的(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)主要優點是(shi)能(neng)夠提高(gao)檢測(ce)靈(ling)敏度(du)。這(zhe)在(zai)很大(da)程度(du)上是(shi)由于鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)的(de)四聚體構(gou)象。一(yi)(yi)種(zhong)鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)蛋白能(neng)夠以高(gao)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)力和(he)(he)(he)選擇性(xing)結(jie)(jie)合四種(zhong)生物(wu)素(su)分子。這(zhe)種(zhong)多(duo)(duo)樣性(xing)能(neng)夠放大(da)弱信(xin)號(hao)，并(bing)通(tong)過簡單的(de)工作流程提高(gao)哺(bu)乳動(dong)物(wu)細胞或組織中(zhong)中(zhong)低豐(feng)度(du)目標的(de)檢測(ce)靈(ling)敏度(du)。另一(yi)(yi)個(ge)(ge)關鍵優勢是(shi)生物(wu)素(su)-鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)系(xi)統的(de)多(duo)(duo)功能(neng)性(xing)。因為(wei)鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)可(ke)以與(yu)多(duo)(duo)種(zhong)報告標簽結(jie)(jie)合，所(suo)以它可(ke)以很容易地(di)結(jie)(jie)合到幾乎所(suo)有(you)的(de)免疫測(ce)定中(zhong)。例如，鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)的(de)酶偶聯物(wu)廣泛用于酶聯免疫吸附試(shi)驗 (ELISA)，而熒(ying)光標記的(de)鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)，如iFluor 488鏈(lian)霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)素(su)，則廣泛用于細胞表面標記、熒(ying)光細胞分選 (FACS) 和(he)(he)(he)其他(ta)熒(ying)光檢測(ce)成像應用。
鏈(lian)霉親和素(su)-生物素(su)標記(ji)抗(kang)體相互作用(yong)的圖示
4. 生物素(su)標簽(qian)的應用
在許(xu)多蛋白質研究(jiu)應用(yong)中，生(sheng)物素(su)(su)標記（即生(sheng)物素(su)(su)化）的蛋白質常(chang)規用(yong)Streptavidin結合物檢測(ce)或純化，包括
酶(mei)聯免(mian)疫吸(xi)附試驗(yan) (ELISA)
免疫組織化學(xue) (IHC)
Power Styramide 信號(hao)放大(da)，是酪(lao)胺的替代品
免疫(yi)印跡
免疫熒(ying)光顯微鏡(jing)
細胞表面標記
親(qin)和純(chun)化
熒光細(xi)胞分選(xuan) (FACS)
流式細(xi)胞術
Dynabeads 鏈(lian)霉親和(he)素(su)相關磁珠的應用 5. 生物素標記的大(da)致流程：
待標記物的蛋(dan)白濃度不能(neng)過低(di)，如若濃度過低(di)需經超濾濃縮等手段提高濃度至0.1mg/mL以上。 一個蛋(dan)白(bai)質(zhi)可能被(bei)多個生物(wu)(wu)素(su)標記(ji)，標記(ji)時，生物(wu)(wu)素(su)與待標記(ji)物(wu)(wu)應有合適的比(bi)例(li)，確保(bao)標記(ji)后不(bu)影響待標記(ji)物(wu)(wu)的活性。推薦生物(wu)(wu)素(su)：抗原蛋(dan)白(bai)比(bi)例(li)為(wei)1~3：1，生物(wu)(wu)素(su)：抗體比(bi)例(li)為(wei)5~20：1或根(gen)據標記(ji)試劑(ji)盒說(shuo)明書推薦比(bi)例(li)。 為減少空間(jian)位(wei)阻影響，基于檢測靈敏度(du)特異性等要求，可在(zai)生物(wu)(wu)素(su)與(yu)被標記物(wu)(wu)之間(jian)加入交聯臂結構。 如果偶聯基(ji)團(tuan)為氨基(ji)，待標記(ji)物的(de)系(xi)統(tong)不得含有游離的(de)氨基(ji)（Tris,氨基(ji)酸）、載體蛋白（BSA）或者其他干(gan)擾物(wu)，若(ruo)有干(gan)擾物(wu)需要用標記緩沖液反復超濾確保其去除干(gan)凈，若(ruo)采用其他基團偶(ou)聯試劑，待標記物(wu)系統(tong)亦不能有含(han)對(dui)應的游(you)離基團的物(wu)質。 如(ru)果待標記(ji)物(wu)為分子量(liang)較(jiao)小的(de)物(wu)質(zhi)，在(zai)純化過程中(zhong)注(zhu)意超(chao)濾管、脫鹽(yan)柱、透析(xi)袋的(de)截留分子量(liang)。 標記反應后的(de)體積(ji)量至少在(zai)100μL以上，以達到純化時的(de)最(zui)小上樣量。 標記反(fan)應(ying)完成后（氨基偶聯體系），可在體系中加入適(shi)量的(de)含(han)游離含(han)氨基小分子物質，中和(he)游離的(de)生物素(su)活(huo)化試劑，提高純化效率，減少后續反(fan)應(ying)的(de)假陽(yang)性和(he)高背(bei)景。 純(chun)化(hua)后(hou)的標記(ji)蛋白可采用A280或BCA法測定蛋白含量(liang)。 標記純化后的蛋白(bai)可根據蛋白(bai)性質進行分裝長期保存，減少凍融次(ci)數。
蛋白互作中(zhong)利用臨(lin)近連接法用生(sheng)物素標記互作蛋白 可(ke)通過生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)連(lian)接酶(mei)(Biotin-protein ligase, BirA)對(dui)Avi標(biao)(biao)簽(qian)融(rong)合蛋白(bai)(bai)或(huo)(huo)多(duo)肽快捷、高效地進行(xing)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)(biao)記(ji)。生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)(biao)記(ji)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)可(ke)使(shi)用(yong)(yong)基于Streptavidin或(huo)(huo)Avidin方法進行(xing)純化(hua)或(huo)(huo)檢(jian)(jian)測(ce)，例(li)如(ru)使(shi)用(yong)(yong)Streptavidin磁(ci)珠(zhu)對(dui)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)(biao)記(ji)蛋白(bai)(bai)進行(xing)純化(hua)，或(huo)(huo)用(yong)(yong)HRP等(deng)標(biao)(biao)記(ji)的(de)(de)Streptavidin對(dui)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)(biao)記(ji)蛋白(bai)(bai)進行(xing)檢(jian)(jian)測(ce)。Avi標(biao)(biao)簽(qian)是由15個(ge)氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)組成的(de)(de)短肽標(biao)(biao)簽(qian)，在ATP和生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)存在的(de)(de)條件下，BirA在Avi標(biao)(biao)簽(qian)的(de)(de)賴氨酸殘基上(shang)連(lian)接一個(ge)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)，從而實現(xian)目的(de)(de)蛋白(bai)(bai)的(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)(biao)記(ji)。 生物素連接酶BirA特(te)(te)異性的生物素標(biao)記Avi標(biao)簽有(you)多方(fang)面的優點。Avi標(biao)簽小(xiao)且對融合(he)蛋(dan)白的影響非常小(xiao)，只針對Avi標(biao)簽上(shang)的Lys殘基進行特(te)(te)定位置的生物素標(biao)記，生物素標(biao)記效率(lv)高，可(ke)重復性好；體(ti)(ti)內或(huo)體(ti)(ti)外(wai)均可(ke)進行標(biao)記，標(biao)記后的蛋(dan)白與鏈霉親和(he)(he)素(Streptavidin)的親和(he)(he)力高(gao)，從而使Avi-tag技術可(ke)以應用于目的蛋白的固定吸附、純化和(he)(he)檢測等；相比于傳(chuan)統生(sheng)物素化學標記(ji)的非特異(yi)性位(wei)點的標記(ji)，BirA催化的反(fan)應條件更溫和(he)(he)、更簡單(dan)，對被標記(ji)蛋白活力影響小，酶活效率高(gao)，標記(ji)特異(yi)性強。 
6. 生物素(su)化核苷(gan)酸(suan)及(ji)oligo 生物素(su)修(xiu)飾的(de)(de)三磷(lin)酸核(he)苷類(lei)似物，如 dUTP 和 dCTP，可以通過酶促整(zheng)合到(dao) DNA 或 RNA 片(pian)段(duan)中，用于熒(ying)光原位雜交 (FISH)、DNA 陣列、微陣列和其他(ta)雜交技術。標(biao)準酶促非放射性(xing)DNA標(biao)記(ji)反應，包(bao)括3'末端標(biao)記(ji)、cDNA 標(biao)記(ji)、切口(kou)平移(yi)、PCR和隨(sui)機引(yin)物標(biao)記(ji)。每個(ge)生物素(su)化核(he)苷酸在生物素(su)與其在核(he)苷酸上(shang)的(de)(de)連接點之間包(bao)含一個(ge) 11、14、16 或 20 個(ge)原子的(de)(de)間隔區(qu)。例如常(chang)見的(de)(de)Biotin-dATP或(huo)(huo)Biotin-dCTP被(bei)用(yong)于HiC實(shi)(shi)驗添加到酶切口處；生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)linker(21bp dsDNA)可(ke)用(yong)于ChIAPET實(shi)(shi)驗中(zhong)(zhong)連接兩個(ge)染(ran)色質DNA片段；在RNA pull down實(shi)(shi)驗中(zhong)(zhong)用(yong)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記RNA（SP6或(huo)(huo)T7體(ti)(ti)(ti)(ti)外(wai)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)過(guo)程中(zhong)(zhong)，以(yi)Biotin-16-UTP部分取代UTP，從而轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)生(sheng)成(cheng)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)RNA探針或(huo)(huo)mRNA。由(you)于使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)RNA Polymerase對天然核苷酸(NTP)和(he)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記核苷酸(Biotin-NTP)沒有選(xuan)擇傾向性，因此每個(ge)RNA轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)產物(wu)(wu)(wu)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)程度可(ke)以(yi)通過(guo)調節轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)反應(ying)中(zhong)(zhong)NTP與Biotin-NTP的(de)(de)(de)比例(li)(li)來控制。一(yi)些試劑盒將Biotin-16-UTP的(de)(de)(de)比例(li)(li)控制在約35%，使(shi)反應(ying)和(he)標(biao)(biao)記效率之間達到較(jiao)好的(de)(de)(de)平衡。得到的(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)RNA探針或(huo)(huo)mRNA可(ke)使(shi)用(yong)熒(ying)光基團、酶或(huo)(huo)抗體(ti)(ti)(ti)(ti)偶(ou)聯的(de)(de)(de)鏈霉親和(he)素(Streptavidin)進行檢測，應(ying)用(yong)與RNA pulldown或(huo)(huo)其(qi)他(ta)富集實(shi)(shi)驗。）逆轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)反應(ying)中(zhong)(zhong)使(shi)用(yong)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素修飾(shi)的(de)(de)(de)引物(wu)(wu)(wu)合成(cheng)帶有生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)cDNA；此外(wai)，RNA-seq文庫構(gou)建中(zhong)(zhong)，生(sheng)物(wu)(wu)(wu)素標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)Oligo(dT)與mRNA3''端的(de)(de)(de)poly A退火形成(cheng)雜交體(ti)(ti)(ti)(ti)，然后用(yong)帶有鏈霉親和(he)素的(de)(de)(de)順磁(ci)磁(ci)珠(zhu)(zhu)洗滌并(bing)捕(bu)獲雜交體(ti)(ti)(ti)(ti)，形成(cheng)雜交體(ti)(ti)(ti)(ti)－磁(ci)珠(zhu)(zhu)復合體(ti)(ti)(ti)(ti)，最(zui)后用(yong)磁(ci)架將此復合體(ti)(ti)(ti)(ti)捕(bu)獲；
7. 生物素化抗體
在做western blot或免疫組化(hua)時常使(shi)用(yong)一抗(kang)(kang)二抗(kang)(kang)來放大、顯示(shi)抗(kang)(kang)原，用(yong)酶或熒(ying)光標(biao)記(ji)(ji)(ji)二抗(kang)(kang)。生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化(hua)的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)，是(shi)在抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)上連接生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)（biotin），生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)能和(he)(he)(he)(he)(he)親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)素(su)(su)(su)(su)（avitin）特異(yi)性(xing)高親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)性(xing)結(jie)(jie)合，親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)力是(shi)抗(kang)(kang)原抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)結(jie)(jie)合的(de)一萬倍，而且一個(ge)avidin可以(yi)結(jie)(jie)合四(si)個(ge)biotin，這樣又起(qi)到級聯放大的(de)作用(yong)。所(suo)以(yi)能更(geng)加靈(ling)敏的(de)顯示(shi)微量抗(kang)(kang)原，這種方法(fa)也(ye)稱親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)免疫組化(hua)。目前(qian)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)蛋白標(biao)記(ji)(ji)(ji)技(ji)術(shu)已被廣泛用(yong)于(yu)醫學病理學、免疫組織化(hua)學、分(fen)子生(sheng)物(wu)(wu)學、生(sheng)物(wu)(wu)制藥等領域的(de)分(fen)析研究(jiu)與(yu)技(ji)術(shu)測定，常見的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)標(biao)記(ji)(ji)(ji)技(ji)術(shu)包括生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化(hua)標(biao)記(ji)(ji)(ji)法(fa)，酶標(biao)記(ji)(ji)(ji)法(fa)，熒(ying)光素(su)(su)(su)(su)標(biao)記(ji)(ji)(ji)法(fa)和(he)(he)(he)(he)(he)膠體(ti)(ti)(ti)(ti)金標(biao)記(ji)(ji)(ji)法(fa)。生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)化(hua)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)標(biao)記(ji)(ji)(ji)的(de)樣品(pin)可應用(yong)酶標(biao)或熒(ying)光染料標(biao)記(ji)(ji)(ji)的(de)親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)素(su)(su)(su)(su)或生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)-親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)素(su)(su)(su)(su)復合物(wu)(wu)來檢測。生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)-SP是(shi)其(qi)6原子間隔位于(yu)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)和(he)(he)(he)(he)(he)其(qi)共軛(e)的(de)蛋白質之間。當生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)-SP結(jie)(jie)合抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)用(yong)于(yu)酶免疫測定時，與(yu)沒有間隔的(de)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)結(jie)(jie)合抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)相比(bi)，靈(ling)敏度(du)會提高。當生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)-SP共軛(e)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)與(yu)堿性(xing)磷酸酶共軛(e)鏈維(wei)定一起(qi)使(shi)用(yong)時，這一點(dian)尤為明(ming)顯。顯然，長間隔將生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)(su)部分(fen)從(cong)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)表面延(yan)伸出去，使(shi)其(qi)更(geng)容易接觸(chu)到鏈霉親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)(he)(he)(he)素(su)(su)(su)(su)的(de)結(jie)(jie)合位點(dian)。
生物素-SP分子(zi)。分子(zi)量454.54 Da。左22.4 ?。
圖2. 標記鏈酶親和(he)素(su)(su)(su)生(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)法（LSAB）。A. 一抗體(ti)檢測靶抗原。B. 生(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)二(er)抗可識別(bie)一抗。C. HRP偶(ou)連鏈酶親和(he)素(su)(su)(su)與(yu)(yu)生(sheng)物(wu)素(su)(su)(su)化(hua)的(de)二(er)抗體(ti)結(jie)合，與(yu)(yu)HRP偶(ou)聯的(de)二(er)抗相比，能夠顯著增強信號。
8. 如何從鏈霉親和素磁珠(zhu)上解離生物素化分子?
鏈(lian)霉(mei)親和素-生(sheng)物(wu)素相互作(zuo)用是已知的(de)蛋白(bai)與(yu)其(qi)他分子間非共價的(de)生(sheng)物(wu)相互作(zuo)用。生(sheng)物(wu)素與(yu)鏈(lian)霉(mei)親和素間的(de)鍵形(xing)成非常迅速(su)，一旦形(xing)成，就不會受到(dao)pH、溫度、有機溶劑(ji)和其(qi)他變性劑(ji)等多種因素的(de)影響。從鏈(lian)霉親(qin)和(he)素(su)上分離生(sheng)物素(su)時，如(ru)果實驗中使用(yong)的(de)是生(sheng)物素(su)的(de)衍(yan)生(sheng)物或經修飾(shi)的(de)鏈(lian)霉親(qin)和(he)素(su)，那么需要特定形式和(he)通(tong)常(chang)溫和(he)的(de)方法解(jie)離，除此之外通(tong)常(chang)情況下都(dou)需要非常(chang)劇烈的(de)方法解(jie)離，并(bing)且會(hui)使鏈(lian)霉親(qin)和(he)素(su)變性。下面探討了其(qi)中兩種(zhong)方法。
生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)化核(he)酸：為了從(cong)Dynabeads鏈霉(mei)親和(he)素(su)(su)磁(ci)(ci)珠(zhu)上(shang)(shang)分離(li)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)化核(he)酸，在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中(zhong)孵(fu)育(yu)磁(ci)(ci)珠(zhu)，65°C孵(fu)育(yu)5分鐘(zhong)或(huo)90°C孵(fu)育(yu)2分鐘(zhong)。使用(yong)磁(ci)(ci)力(li)架將(jiang)磁(ci)(ci)珠(zhu)吸(xi)到(dao)試(shi)管(guan)壁(bi)上(shang)(shang)，將(jiang)含(han)有(you)(you)(you)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)化核(he)酸的上(shang)(shang)清液從(cong)試(shi)管(guan)中(zhong)取出。有(you)(you)(you)研究提(ti)到(dao)，在高溫(120C，15分鐘(zhong))下，才能在鹽溶液中(zhong)解離(li)。另外(wai)，在6 mol/L鹽酸胍溶液(pH 1.5)中(zhong)也(ye)可解離(li)；有(you)(you)(you)研究指出，生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)標(biao)記的核(he)酸探針不能用(yong)酚抽提(ti)，否則生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)核(he)酸會進入酚層而損失；Holmberg等(deng)（Electrophoresis 26, 501-510, 2005）報道稱，在用(yong)離(li)子水短時間孵(fu)育(yu)后(hou)，可將(jiang)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)化DNA從(cong)鏈霉(mei)親合素(su)(su)磁(ci)(ci)珠(zhu)上(shang)(shang)釋放（未(wei)進行測試(shi)）。
生(sheng)物(wu)素(su)化蛋白(bai)質：對于生(sheng)物(wu)素(su)化蛋白(bai)質，則可在0.1% SDS或SDS-PAGE緩沖液中煮沸磁珠(zhu)3分(fen)鐘(zhong)。
9. 鏈霉親(qin)和素(su)磁(ci)珠結(jie)合(he)(he)片段的(de)長度和結(jie)合(he)(he)能力為多少?
由于(yu)具有空間位阻(zu)，因(yin)此結(jie)(jie)合(he)(he)能(neng)(neng)力(li)取決于(yu)片(pian)(pian)段(duan)(duan)大(da)(da)小。例如，500 bp片(pian)(pian)段(duan)(duan)在Dynabeads M-280鏈霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)素(su)磁(ci)珠(zhu)上的(de)(de)結(jie)(jie)合(he)(he)量是1,000 bp片(pian)(pian)段(duan)(duan)的(de)(de)2倍。長DNA片(pian)(pian)段(duan)(duan)會(hui)占據磁(ci)珠(zhu)周圍更(geng)(geng)多空間，使(shi)(shi)其更(geng)(geng)難“找到"磁(ci)珠(zhu)上的(de)(de)鏈霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)素(su)。較短(duan)的(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)(duan)更(geng)(geng)易接(jie)近鏈霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)素(su)。對于(yu)大(da)(da)于(yu)2kb的(de)(de)DNA片(pian)(pian)段(duan)(duan)，推薦(jian)(jian)使(shi)(shi)用(yong)Dynabeads kilobaseBINDER™試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)。該試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)包括Dynabeads M-280鏈霉(mei)(mei)親(qin)(qin)和(he)(he)素(su)磁(ci)珠(zhu)和(he)(he)一種可(ke)增強長生物素(su)化DNA片(pian)(pian)段(duan)(duan)（大(da)(da)于(yu)2kb）固定的(de)(de)結(jie)(jie)合(he)(he)液。對于(yu)大(da)(da)于(yu)1-2kb的(de)(de)DNA片(pian)(pian)段(duan)(duan)，推薦(jian)(jian)使(shi)(shi)用(yong)Dynabeads kilobaseBINDER™試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)，因(yin)為結(jie)(jie)合(he)(he)液可(ke)增強結(jie)(jie)合(he)(he)能(neng)(neng)力(li)。該結(jie)(jie)合(he)(he)液可(ke)使(shi)(shi)DNA線性化，進而伸展(zhan)且堿基(ji)堆疊成剛性結(jie)(jie)構（不(bu)適用(yong)于(yu)質粒或環狀核酸等較短(duan)的(de)(de)片(pian)(pian)段(duan)(duan)）。
鹽濃度(du)可影響(xiang)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化核(he)酸與(yu)(yu)Dynabeads鏈霉(mei)親和(he)素(su)磁(ci)珠(zhu)(zhu)的結(jie)合效率(lv)。對于(yu)1kb以(yi)內的生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化DNA片段(duan)，最佳結(jie)合條件為1M NaCl（終濃度(du)），25℃孵育(yu)15分鐘；較長的DNA片段(duan)應(ying)(ying)固定過(guo)(guo)夜。生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化抗體應(ying)(ying)在(zai)含0.1% BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中固定。由(you)于(yu)游離(li)(li)(li)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)與(yu)(yu)Dynabeads鏈霉(mei)親和(he)素(su)磁(ci)珠(zhu)(zhu)結(jie)合的速度(du)比大分子(zi)(zi)更快，因此應(ying)(ying)確(que)保(bao)樣本不含過(guo)(guo)量的游離(li)(li)(li)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)。應(ying)(ying)使用(yong)HPLC或FPLC回收(shou)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化寡核(he)苷酸，以(yi)避免樣本中游離(li)(li)(li)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)的存在(zai)。由(you)于(yu)待固定的特定分子(zi)(zi)的大小和(he)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)化過(guo)(guo)程都將影響(xiang)磁(ci)珠(zhu)(zhu)的結(jie)合能(neng)力，因此，可采(cai)用(yong)滴定法優化每個單獨應(ying)(ying)用(yong)中的磁(ci)珠(zhu)(zhu)使用(yong)量。
10. Dynabeads鏈酶(mei)親和(he)素磁珠是無(wu)RNase的(de)嗎?
Dynabeads鏈霉親和素(su)磁珠(zhu)不是以(yi)無RNase溶(rong)液(ye)的(de)形式提(ti)供的(de)。處(chu)理RNA時(shi)(shi)，應使用DEPC處(chu)理的(de)0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶(rong)液(ye)清洗磁珠(zhu)2次(ci)，每次(ci)1-3分(fen)鐘(zhong)。DEPC毒(du)性很(hen)強。但能去除RNase。清洗后，可使用DEPC處(chu)理的(de)0.1 MNaCl溶(rong)液(ye)重(zhong)懸磁珠(zhu)。"DEPC處(chu)理"是指：加入0.1% DEPC，混合，室(shi)溫下解育1小(xiao)時(shi)(shi)。隨(sui)后，將DEPC處(chu)理的(de)溶(rong)液(ye)進(jin)行高壓滅(mie)菌，以(yi)破壞DEPC。
11. 如何去除雙鏈DNA中的非生物素(su)化鏈？
可(ke)通(tong)(tong)過堿(jian)(jian)處(chu)理(li)或(huo)高溫處(chu)理(li)分(fen)離DNA雙鏈。采(cai)取堿(jian)(jian)處(chu)理(li)時，可(ke)使用0.1 M NaOH洗(xi)脫非(fei)生物素化鏈。通(tong)(tong)常情況下，該處(chu)理(li)方法不(bu)會對(dui)磁(ci)珠產生任何影響。在(zai)NaOH處(chu)理(li)前，在(zai)2X結(jie)合(he)(he)和洗(xi)滌緩(huan)沖液(ye)（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中清洗(xi)Dynabeads/DNA復合(he)(he)物1次，除去(qu)上(shang)(shang)清液(ye)。高鹽濃度將(jiang)有助(zhu)于減少電荷(he)，從(cong)而(er)使非(fei)特異性結(jie)合(he)(he)最(zui)小化。向Dynabeads/DNA復合(he)(he)物中加入新鮮配制（很(hen)重要）的(de)0.1 M NaOH溶液(ye)，室溫下旋(xuan)轉孵育2-3分(fen)鐘（最(zui)多5分(fen)鐘）。除去(qu)含(han)有非(fei)生物素化鏈的(de)上(shang)(shang)清液(ye)。再(zai)(zai)用0.1 M NaOH溶液(ye)清洗(xi)Dynabeads/DNA復合(he)(he)物1次，除去(qu)上(shang)(shang)清液(ye)。第一(yi)次洗(xi)脫時，即(ji)可(ke)洗(xi)脫下大部分(fen)DNA。除了堿(jian)(jian)處(chu)理(li)，也(ye)可(ke)進(jin)行加熱處(chu)理(li)，在(zai)水中95°C加熱5分(fen)鐘即(ji)可(ke)。為防止再(zai)(zai)退火，堿(jian)(jian)處(chu)理(li)或(huo)高溫處(chu)理(li)后必須快(kuai)速從(cong)磁(ci)珠上(shang)(shang)分(fen)離DNA，最(zui)好在(zai)冰上(shang)(shang)操作(zuo)。加熱會在(zai)一(yi)定程度（在(zai)水中約(yue)為7%）上(shang)(shang)引起生物素化DNA從(cong)鏈霉親(qin)和素上(shang)(shang)解(jie)離。因此，通(tong)(tong)常更推薦(jian)采(cai)用堿(jian)(jian)處(chu)理(li)法。
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