一、介紹

小(xiao)鼠精原細胞（GC-1 spg）為貼壁(bi)細胞(bao)(bao)，細胞(bao)(bao)形態呈上皮細胞(bao)(bao)樣。

二、主要耗材、儀器及試劑

15ml離(li)心管(guan)、50ml離(li)心管(guan)、凍(dong)存管(guan)、巴氏滴管(guan)、培(pei)養瓶(ping)、封(feng)口膜、CO2培(pei)養箱、離(li)心機(ji)、顯微鏡、生物安全(quan)柜、DMEM、胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液、青(qing)-鏈霉素（雙抗）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）等等。

三、培養流程

1. 細胞復(fu)蘇

1)擦拭生物安(an)全(quan)柜臺面，準(zhun)備好所需耗材(cai)，紫外30min，打(da)開37℃恒溫水浴箱(xiang)預(yu)熱(re)所用試(shi)劑(ji)；

2)按照DMEM＋10% FBS＋1% P/S的比(bi)例(li)配制(zhi)血(xue)清(qing)培養基，吹(chui)打(da)混(hun)勻(yun)后(hou)按10倍細胞(bao)的體(ti)積分裝至15ml離心管中；

3)從液氮中取出GC-1 spg細胞，在水浴(yu)箱中快速晃動使其(qi)融化；

4)將細胞懸液轉移至提前分裝有血清培養(yang)基的離心(xin)管中，吹打混勻；

5)1200rpm，離心(xin)3min；

6)棄去廢液，向離(li)心(xin)管中重新(xin)(xin)加(jia)入新(xin)(xin)的(de)培(pei)養基，重懸GC-1 spg細胞(bao)沉淀，并轉移(yi)至(zhi)培(pei)養瓶中進行(xing)培(pei)養。

2. 細胞傳(chuan)代

1)細胞密度超過80%即可進行傳代，拿(na)出細胞，棄去舊培養液；

2)用PBS沖洗細胞2-3次（動(dong)作要輕柔，清洗時可搖晃培養瓶以(yi)保證清洗效果）；

3)棄去廢液，向培養瓶中加入事先預熱好的胰蛋白酶（用(yong)量要足(zu)以覆蓋細(xi)胞(bao)層），輕輕晃動培養瓶以利于消化；

4)1min左右后(hou)在顯微(wei)鏡下觀察細(xi)胞，當(dang)90%細(xi)胞被消(xiao)化下來時，向培養(yang)瓶中加入2-3ml的血清培養基，終止消化；

5)收集細胞(bao)懸液(ye)至15ml離(li)心管中，1200rpm，離(li)心3min；

6)等待離心過(guo)程(cheng)中，可提前(qian)在(zai)新的培(pei)(pei)養(yang)瓶中加好完培(pei)(pei)（如T25培(pei)(pei)養(yang)瓶可先加4ml完培(pei)(pei)）；

7)棄(qi)去廢液，用2ml的完培(pei)重懸細胞(bao)后分裝至新(xin)的培(pei)養瓶中；

8)蓋上培養(yang)瓶蓋子(zi)，以劃(hua)“十(shi)字"的方式晃動(dong)培養(yang)瓶，以使細(xi)胞分(fen)布均勻，置于(yu)37℃，5%-10%CO2培養箱中進行培養。

3. 細胞凍(dong)存

1)從培養箱中取出培養瓶，棄去舊的培養液，用PBS清洗2-3次；

2)加入預熱的胰蛋白酶消(xiao)化細(xi)胞，鏡下觀察消(xiao)化后加入2-3ml完培終止(zhi)消(xiao)化；

3)收(shou)集(ji)細胞(bao)懸液至15ml離(li)(li)心(xin)管中，1200rpm，離(li)(li)心(xin)3min；

4)等待(dai)離心過程中(zhong)，按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的(de)比例配制(zhi)凍存(cun)液；

5)離心(xin)結束后，棄去上清(qing)，向離心(xin)管中加入凍(dong)存(cun)(cun)液，重懸細胞(bao)，分裝至(zhi)凍(dong)存(cun)(cun)管中；

6)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出細胞置于液氮罐中保存。

四、注意事項

1．培養細胞所用(yong)的培養基(ji)及血清等試劑最好(hao)沿用(yong)之前的，切忌頻繁更換(huan)；

2．棄去舊(jiu)的培養(yang)液時最好不要直接倒掉，以(yi)免(mian)瓶口有殘留造成污(wu)染；

3．用胰酶消化細(xi)胞(bao)時，可輕輕晃(huang)動培養瓶(ping)(ping)(ping)，并在顯微鏡下(xia)觀(guan)察，細(xi)胞(bao)間(jian)隙變(bian)大，輕晃(huang)培養瓶(ping)(ping)(ping)細(xi)胞(bao)可自然流(liu)下(xia)時即可終止(zhi)消化，切忌劇烈拍打培養瓶(ping)(ping)(ping)；

4．對于(yu)難消化(hua)(hua)的(de)細胞可以(yi)分(fen)兩次進(jin)行(xing)消化(hua)(hua)，以(yi)防胰酶(mei)消化(hua)(hua)時間(jian)過長對細胞造成損(sun)傷；

5．一定(ding)要分清(qing)細胞培養瓶的正(zheng)反面(mian)。

以(yi)上就是本期的(de)內容，更多資訊(xun)，。

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