轉染是將(jiang)外源性基因導入細胞(bao)內(nei)的一種專門技術。分為

物理介導方法：電穿孔法、顯微注射和基因槍；

化學介導方法：如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；

生物介導方法：有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術，是目前最高轉染效率的方法，同時具(ju)有細胞毒性很低的優勢。

但是病毒轉(zhuan)染(ran)方(fang)法(fa)的(de)準備(bei)程序復雜，常常對(dui)細(xi)胞(bao)類型(xing)有很強(qiang)的(de)選擇性，在一般實驗(yan)室(shi)中(zhong)很難普及。其它(ta)物(wu)理和(he)(he)化學介(jie)導的(de)轉(zhuan)染(ran)方(fang)法(fa)，則各有其特點(dian)。需要指出的(de)一點(dian)，無論采用(yong)哪種轉(zhuan)染(ran)技(ji)術，要獲(huo)得(de)*的(de)轉(zhuan)染(ran)結果，可能(neng)都需要對(dui)轉(zhuan)染(ran)條件(jian)(jian)進行優化。影響轉(zhuan)染(ran)效率(lv)的(de)因素很多(duo)，從(cong)細(xi)胞(bao)類型(xing)、細(xi)胞(bao)培(pei)養條件(jian)(jian)和(he)(he)細(xi)胞(bao)生長狀態到轉(zhuan)染(ran)方(fang)法(fa)的(de)操作細(xi)節。下面列(lie)舉一些影響因素。

A、DNA-陽離子脂質體復(fu)(fu)合物形成時不(bu)能含血清(qing)，因為血清(qing)會影響復(fu)(fu)合物的(de)形成。

B、一般細(xi)胞對無血清培(pei)養(yang)可(ke)以(yi)耐受幾個(ge)小時(shi)沒(mei)問題，轉染用的培(pei)養(yang)液可(ke)以(yi)含血清也可(ke)以(yi)不加(jia)，但血清一度曾被認(ren)為(wei)會(hui)降(jiang)低轉染效率，轉染培(pei)養(yang)基(ji)中加(jia)入血清需(xu)要(yao)對條(tiao)件進行優化。

C、對于對血清缺乏比較敏(min)感(gan)(gan)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，可以(yi)使(shi)用(yong)營養(yang)豐(feng)富(fu)的(de)無(wu)血清培(pei)養(yang)基，或者在(zai)轉(zhuan)(zhuan)染培(pei)養(yang)基中使(shi)用(yong)血清。對血清缺乏比較敏(min)感(gan)(gan)的(de)貼壁(bi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，建議使(shi)用(yong)專用(yong)轉(zhuan)(zhuan)染試(shi)劑(ji)。有條件的(de)話(hua)，可以(yi)用(yong)無(wu)血清培(pei)養(yang)基代替PBS洗細(xi)(xi)胞(bao)(bao)兩遍，注意洗的(de)時候(hou)要輕(qing)，靠(kao)邊緣緩緩加入液(ye)體(ti)(ti)，然后不要吹(chui)吸細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，而是轉(zhuan)(zhuan)動培(pei)養(yang)板讓液(ye)體(ti)(ti)滾動在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面。如果洗的(de)太厲害，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)又損失一(yi)部分，加了(le)脂(zhi)質體(ti)(ti)后，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)受(shou)影響就更大了(le)，死(si)亡細(xi)(xi)胞(bao)(bao)會增多。

抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)，比(bi)(bi)如青(qing)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)和鏈霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)，是影響(xiang)轉染(ran)(ran)的培(pei)養(yang)基添加(jia)物(wu)。這(zhe)些抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)一般對(dui)于真(zhen)核細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)無毒，但(dan)陽離子脂(zhi)質體試劑(ji)增加(jia)了細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的通透性(xing)，使(shi)抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)可以進入細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。這(zhe)降低了細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的活(huo)性(xing)，導致轉染(ran)(ran)效(xiao)率低。所(suo)以，在(zai)轉染(ran)(ran)培(pei)養(yang)基中(zhong)不能使(shi)用(yong)抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)，甚(shen)至在(zai)準備轉染(ran)(ran)前進行細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)鋪(pu)板時也要避(bi)免使(shi)用(yong)抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)。這(zhe)樣，在(zai)轉染(ran)(ran)前也不必潤洗(xi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。對(dui)于穩定轉染(ran)(ran)，不要在(zai)選擇性(xing)培(pei)養(yang)基中(zhong)使(shi)用(yong)青(qing)霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)和鏈霉(mei)素(su)(su)(su)(su)(su)，ICIN選擇性(xing)抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)的競爭(zheng)性(xing)抑制劑(ji)。另外，為了保證無血(xue)清培(pei)養(yang)基中(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的健康生長，使(shi)用(yong)比(bi)(bi)含血(xue)清培(pei)養(yang)基更少的抗(kang)(kang)生素(su)(su)(su)(su)(su)量。

這(zhe)點非(fei)(fei)常重要(yao)(yao)，不(bu)要(yao)(yao)急(ji)于(yu)求成(cheng)，一(yi)定要(yao)(yao)讓細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)處于(yu)最佳的(de)(de)生長狀態(tai)再做(zuo)。有文獻說傳代不(bu)要(yao)(yao)超(chao)過17代。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)復蘇后(hou)的(de)(de)3代左右(you)時細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)狀態(tai)最好，不(bu)要(yao)(yao)用(yong)傳了很多代的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)去做(zuo)，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)形(xing)態(tai)都會(hui)發生變(bian)(bian)化(hua)。大(da)多數(shu)已(yi)建立(li)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)都是非(fei)(fei)整倍體，原(yuan)代培(pei)養包括了表達不(bu)同基(ji)因組合的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)混合物。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養在實驗(yan)室(shi)中保存(cun)數(shu)月(yue)和(he)數(shu)年后(hou)會(hui)經歷突變(bian)(bian)，總染色體重組或基(ji)因調控變(bian)(bian)化(hua)等而(er)演(yan)化(hua)。這(zhe)會(hui)導致和(he)轉染相關的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)行為的(de)(de)變(bian)(bian)化(hua)。如(ru)果(guo)(guo)隨時間發現這(zhe)種變(bian)(bian)化(hua)，融化(hua)一(yi)管新鮮的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)可(ke)能(neng)會(hui)恢復原(yuan)先的(de)(de)轉染活性。因此，如(ru)果(guo)(guo)觀察(cha)到轉染效率降低，可(ke)以試(shi)著轉染新鮮培(pei)養的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)以恢復最佳結果(guo)(guo)。或者，幾(ji)種來源于(yu)經篩選，轉染效率較高細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞(ya)系(xi)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)系(xi)現在有售。

用于轉染的最佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。因轉染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少，容易死。一般轉染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×10⁶細胞/ml，確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。細胞的融合度必須要達到90%才能做。

獲得高(gao)轉染活(huo)(huo)性所需選(xuan)擇的(de)(de)啟動(dong)子(zi)(zi)依賴于選(xuan)用的(de)(de)細胞(bao)系和(he)(he)要表(biao)(biao)達(da)(da)的(de)(de)蛋白。CMV啟動(dong)子(zi)(zi)在(zai)(zai)大(da)多(duo)數(shu)細胞(bao)類(lei)型中(zhong)可以(yi)獲得高(gao)表(biao)(biao)達(da)(da)活(huo)(huo)性。同其他(ta)啟動(dong)子(zi)(zi)，如SV40和(he)(he)RSV(勞斯肉瘤(liu)病毒)相比，在(zai)(zai)BHK-21中(zhong)其活(huo)(huo)性最高(gao)。這三種病毒啟動(dong)子(zi)(zi)在(zai)(zai)T細胞(bao)來源(yuan)的(de)(de)細胞(bao)系，如Jurkat中(zhong)組成(cheng)(cheng)表(biao)(biao)達(da)(da)水平較低。轉染后在(zai)(zai)培養基中(zhong)加入PHA-L和(he)(he)PMA可以(yi)激(ji)活(huo)(huo)Jurkat細胞(bao)中(zhong)CMV啟動(dong)子(zi)(zi)，而(er)單PMA就(jiu)足以(yi)激(ji)活(huo)(huo)KG1和(he)(he)K562(人骨髓瘤(liu)白細胞(bao))中(zhong)的(de)(de)CMV啟動(dong)子(zi)(zi)。SV40啟動(dong)子(zi)(zi)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)在(zai)(zai)含有大(da)T抗(kang)原(存在(zai)(zai)于COS-1和(he)(he)COS-7)時(shi)會提高(gao)，因為大(da)T抗(kang)原可以(yi)刺激(ji)染色體外的(de)(de)合成(cheng)(cheng)。

高質(zhi)量的DNA對于進行高效的轉(zhuan)染至(zhi)關重要(yao)。轉(zhuan)染的質(zhi)粒(li)一定純(chun)度好、濃度高、無內毒素。濃度不要(yao)低于0.35ug/ul。產物表達，48小時mRNA表達最(zui)高；72h蛋(dan)白表達最(zui)高。